IDENTIFIKASI MIKROBA - PEWARNAAN GRAM

IDENTIFIKASI MIKROBA METODE PEWARNAAN GRAM

Mikroorganisme di muka bumi sangat beragam macamnya, bahkan dengan ukuran yang berbeda-beda dan jenis yang berbeda. Pengklasifikasian mikroorganisme akan sulit mendeteksi mikroorganisme dalam lingkungan terbuka tanpa bantuan alat pembesar. Oleh karena itu, dalam mengatasi hal tersebut maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bakteri yang  merupakan salah satu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian mikrobiologi proses pengidentifikasian mikroorganisme, digunakan teknik pewarnaan dalam preparat yang nantinya akan dilihat dengan mikroskop, barulah mikroorganisme dapat di lihat dan di identifikasikan dengan melihat zat warna yang terserap olehmikroorganisme. Pewarnaan mikroorganisme juga di gunakan untuk menunjukkan sebaran dan jenis bahan kimia berbagai komponen sel, sehingga dapat membedakan golongan-golongan dari mikroorganisme. Tidak semua mikroorganisme dapat menyerap zat warna yang sama, maka akan digunakan zat warna sesuai dengan mikroorganisme yan g akan diidentifikasi. Teknik pewarnaan yang sering di gunakan di antaranya adalah pewarnaan gram. Teknik yang digunakan dan tipe medium yang dipilih tergantung dari sifat penelitian yang pertama menumbuhkan sel spesies tertentu, yang mikroorganisme yang teramati secara mikroskopik dan yang tambah dalam lingkungan alam yang terbukti sangat sukar untuk tambah secara murni pada medium buatan. Prinsip dasar dari pewarnaan ini adalah adanya ikatan ion antara komponen seluler dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarnaan yang disebut kromogen. Terjadi ikatan ion karena adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun pada pewarnaan. Berdasarkan adanya muatan ini maka dapat dibedakan pewarna asam dan pewarna basa.

Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah salah satu teknik pewarnaan yang paling penting dan luas yang digunakan untuk mengidentifikasi bakteri. Dalam proses ini, olesan bakteri yang sudah terfiksasi dikenai larutan-larutan berikut : zat pewarna kristal violet, larutan yodium, larutan alkohol (bahan pemucat), dan zat pewarna tandingannya berupa zat warna safranin atau air fuchsin. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (1853–1938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae. Bakteri yang terwarnai dengan metode ini dibagi menjadi dua kelompok, yaitu bakteri Gram Positif dan Bakteri Gram Negatif. Bakteri Gram positif akan mempertahankan zat pewarna kristal violet dan karenanya akan tampak berwarna ungu tua di bawah mikroskop. Bakteri gram negatif akan kehilangan zat pewarna kristal violet setelah dicuci dengan alkohol, dan sewaktu diberi zat pewarna tandingannya yaitu dengan zat pewarna air fuchsin atau safranin akan tampak berwarna merah. Perbedaan warna ini disebabkan oleh perbedaan dalam struktur kimiawi dinding selnya.

Teknik Pewarnaan bukan pekerjaan yang sulit tapi perlu ketelitian dan kecermatan bekerja serta mengikuti aturan dasar yang berlaku. Prinsip dasar dari pewarnaan ini adalah adanya ikatan ion antara komponen seluler dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarnaan yang disebut kromogen. Terjadi ikatan ion karena adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun pada pewarnaan. Berdasarkan adanya muatan ini maka dapat dibedakan pewarna asam dan pewarna basa.

A.    Metode pewarnaan gram

Pewarnaan Gram atau metode Gram disebut juga sebagai metode pewarnaan diferensial karena menggunakan lebih dari satu macam zat warna. Proses identifikasi mikroba metode pewarnaan gram menggunakan olesan bakteri yang sudah terfiksasi dikenai larutan-larutan berikut, zat pewarna kristal violet, larutan yodium, larutan  alkohol (bahan pemucat), dan zat pewarna tandingannya berupa zat warna safranin atau air fuchsin. Bakteri yang terwarnai dengan metode ini dibagi menjadi dua kelompok, yaitu bakteri Gram Positif dan Bakteri Gram Negatif. Bakteri Gram positif akan mempertahankan zat pewarna kristal violet dan karenanya akan tampak berwarna ungu tua di bawah mikroskop. Adapun bakteri gram negatif akan kehilangan zat pewarna kristal violet setelah dicuci dengan alkohol, dan sewaktu diberi zat pewarna tandingannya yaitu dengan zat pewarna atau safranin akan tampak berwarna merah. Perbedaan warna ini disebabkan oleh perbedaan dalam struktur kimiawi dinding selnya. Perbedaan zat warna ini disebabkan oleh perbedaan dalam struktur kimiawi dinding selnya. Prinsip pewarnaan gram didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel bakteri sehingga menyebabkan perbedaan reaksi dengan permeabilitas zat warna dan penambahan larutan pencuci. Identifikasi mikroba dapat dilakukan dengan beberapa cara, diantaranya Identifikasi dengan melihat kriteria fenotip dan dengan melihat kriteria genotip.  Berdasarkan metode tersebut, dapat diketahui Jenis dan sifat dari mikroba yang bersangkutan. Jenis-jenis Identifikasi Mikroba dengan melihat kriteria fenotipnya meliputi, morfologi makroskopis yang dilakukan dengan mengamati karakteristik dari pola pertumbuhan mikroorganisme pada media buatan yang diamati dengan mata telanjang (tanpa alat bantu),  morfologi mikroskopis yang dilakukan dengan mengamati ukuran, bentuk, isi sel, organel sel, dan susunan sel ketika diamati dengan mikroskop pada perbesaran tertentu, karakteristik zat warna (pewarnaan) yaitu kemampuan mikroorganisme untuk biasanya digunakan dengan pemeriksaan secara mikroskopi sebagai bagian dari identifikasi bakteri, karakteristik zat warna (pewarnaan) yaitu kemampuan mikroorganisme untuk menghasilkan warna tertentu bila diberikan reagen tertentu pula. Pewarnaan ini biasanya digunakan dengan pemeriksaan secara mikroskopi sebagai bagian dari identifikasi bakteri, persyaratan lingkungan yaitu kemampuan mikroorganisme untuk hidup pada berbagai suhu, menggunakan oksigen atau gas lain, pada berbagai tingkat pH, atau pun keberadaan ion dan garam lainnya seperti NaCl, persyaratan nutrisi yaitu kemampuan mikroorganisme untuk menggunakan berbagai macam sumber karbon dan nitrogen sebagai substrat bernutrisi ketika tumbuh pada keadaan lingkungan tertentu, resistensi yaitu metode yang menujukkan karakteristik resistensi terhadap antibiotik tertentu, logam berat pada mikroorganisme tertentu, antigen untuk  menentukan karakteristik mikroorganisme dengan berbagai macam metode serologi dan imunologi serta terdapat subseluler dalam penentukan bagian – bagian molekuler sel yang menjadi tipe pada beberapa takson, kelompok organisme, dengan menggunakan metode analisis. Contohnya, komponen dinding sel, membran sel, dan komponen dari enzim dari sel membran. Hal ini sesuai dengan Wahyuningsih (2008) yang menyatakan bahwa Pewarnaan gram menghasilkan dua kelompok besar bakteri, yaitu gram positif yang berwarna ungu dan gram negatif yang berwarna merah.

B.    Reagen yang Digunakan

Proses identifikasi mikroba metode pewarnaan gram umumnya menggunakan zat warna garam-garam yang dibangun oleh ion-ion yang bermuatan positif dan negatif dimana salah satu ion tersebut berwarna. Zat warna dikelompokkan menjadi dua, yaitu zat pewarna yang bersifat asam dan basa. Jika ion yang mengandung warna adalah ion positif maka zat warna tersebut disebut pewarna basa. Prosedur pewarnaan ini menggunakan zat warna basa seperti seperti crystal violet, biru metilen, safranin atau hijau malakit serta  bila ion yang mengandung warna adalah ion negatif maka zat warna tersebut disebut pewarna asam. Contoh dari zat pewarna asam yaitu tinta cina, larutan Nigrosin, asam pikrat, eosin dan lain-lain.. Hal ini sesuai dengan Fitriani (2016)  yang menyatakan bahwa zat warna yang digunakan bersifat asam atau basa. Pada zat warna basa, bagian yang berperan dalam memberikan warna disebut kromofor dan mempunyai muatan  positif. Sebaliknya pada zat warna asam bagian yang berperan memberikan zat warna memiliki muatan negatif. Zat warna basa lebih banyak digunakan karena muatan negatif banyak banyak ditemukan pada permukaan sel. Contoh zat warna basa antara lain Crystal Violet, Methylene Blue, Safranin, Base Fuchsin, Malachite Green dan lain-lain. Sedangkan zat warna asam antara lain Eosin, Congo Red dan lain-lain.

1.      Fungsi Kristal Violet

Kristal violet atau ungu gentian adalah pewarna triarylmethane. Pewarna ini digunakan sebagai histologis noda dalam metode gram klasifikasi bakteri. Kristal violet tersusun dari bubuk kristal violet, etil alcohol, ammonium oksalat dan aquades. Kristal violet  merupakan pewarna primer (utama) yang akan memberikan warna mikroorganisme target. Kristal violet bersifat basa sehingga mampu berikatan dengan sel mikroorganisme yang bersifat asam, dengan begitu sel mikroorganisme yang transparan akan terlihat berwarna ungu. Pada pewarnaan gram, Kristal  violet akan memisah membentuk ion CV⁺ dan Cl^-. Ion tersebut menembus dinding sel bakteri. Ion CV⁺ berinteraksi dengan muatan rganic pada dinding sel sehingga dinding sel berwarna ungu. Hal ini sesuai dengan Hardy (2016) yang menyatakan bahwa kristal violet (CV) berdisosiasi di larutan cair menjadi CV⁺dan Cl^‑.

2.       Fungsi Lugol

Lugol merupakan zat yang digunakan dalam pewarnaan Gram, yaitu sebagai pewarna mordan. Pewarna mordan adalah pewarna yang berfungsi memperkuat pengikatan warna oleh bakteri. Lugol tersusun atas senyawa iodium (I₂₎ dan kalium iodida (KI). Sifat dari iodin yaitu tidak berbau, berwarna coklat, dan asam.  Ketika iodin diteteskan pada preparat bakteri, ion negatif pada iodin akan berikatan dengan kristal violet dan membentuk kompleks besar kristal violet-iodin (CV-I). Kristal violet akan berinteraksi dengan kalium iodida (KI-I₂) melalui pertukaran anion secara sederhana untuk memproduksi presipitat kimia. Anion pada klorin (Cl) digantikan dengan iodida bulkier dan kompleks yang terbentuk menjadi tidak larut dalam air. Hal ini sesuai dengan Dwidjoseputro (2005) yang menyatakan bahwa iodine berfungsi untuk mengikat zat warna primer agar tidak keluar dari sel bakteri.

3.       Fungsi Alkohol

Alkohol merupakan solven organik yang berfungsi untuk membilas atau melunturkan kelebihan zat warna pada sel bakteri. alkohol tersusun dari senyawa etil alkohol dan aseton. Pemberian alkohol (etanol) pada praktikum pewarnaan bakteri, menyebabkan terekstraksi lipid sehingga memperbesar permeabilitas dinding sel. Pemberian alkohol pada pengecatan ini dapat mengakibatkan terjadinya dua kemungkinan yaitu mikroorganisme tetap berwarna ungu kebiruan atau bakteri mejadi tidak berwarna. Pada proses dekolorisasi, alcohol akan berinteraksi dengan lipid membran sel. Bakteri gram negatif akan kehilangan lapisan luar membran sehingga peptidoglikan tak terlindungi lagi. Ikatan CV-I pada bakteri gram negatif ikut keluar bersama membran luar sel. Bakteri gram positif akan mengalami dehidrasi dan ikatan CV-I akan terperangkap di dalam peptidoglikan Hal ini sesuai dengan Subandi (2012) yang menyatakan bahwa alkohol digunakan untuk melunturkan atau membilas zat warna ungu yang mengakibatkan bakteri akan tetap berwarna ungu atau tidak berwarna.

4.       Fungsi Safranin

Safranin dalah noda biologis yang digunakan dalam histologi dan sitologi. Safranin digunakan sebagai counter stain dalam beberapa protokol pewarnaan. Safranin biasanya memilki struktur kimia. Senyawa penyusunnya yaitu safranin o, etil alkohol, dan aquades. Pewarnaan safranin masuk ke dalam sel dan menyebabkan sel menjadi berwarna merah pada bakteri gram negatif sedangkan pada bakteri gram positif dinding selnya terdehidrasi dengan perlakuan alkohol, pori – pori mengkerut, daya rembes dinding sel dan membran menurun sehingga pewarna safranin tidak dapat masuk sehingga sel berwarna ungu. Hal ini sesuai dengan Wahyuningsih (2008) yang menyatakan bahwa Safranin merupakan pewarna tandingan atau pewarna sekunder. Zat ini berfungsi untuk mewarnai kembali sel-sel yang telah kehilangan pewarna utama setelah perlakuan dengan alkohol. Dengan kata lain, memberikan warna pada mikroorganisme non target.

5.      Fungsi Aquades

Aquades adalah air destilasi atau air hasil penyulingan. Aquades hampir tak mengandung mineral di dalamnya. Fungsi dan kegunaan dari aquades yaitu sebagai pelarut saat melarutkan senyawa agar kelebihan warna dapat hilang dan larutan-larutan lainnya dapat masuk ke dinding sel. Serta dalam suatu pewarnaan gram, peran aquades disini sangat diperlukan sebagai cairan pembilas saat telah diberikan zat pewarna. Zat warna yang telah diteteskan lalu dibilas dengan aquades dapat membuat zat warna tambahan terhapus dan akan membuat zat warna asli (ungu) terlihat dengan jelas, maka bakteri tersebut dikatakan bakteri gram positif. Akan tetapi, jika zat warna tambahan (merah) yang ertahan dan membuat zat warna asli tidak Nampak, maka bakteri tersebut dikatakan bakteri gram negatif.  Hal ini sesuai dengan Dwidjoseputro (2005) yang menyatakan bahwa jika sediaan dicuci dengan aquades, lalu dengan alkohol, maka dua kemungkinan dapat terjadi. Pertama, zat warna tambahan terhapus, sehingga yang nampak jelas ialah zat warna asli (ungu) disebut Gram positif. Kedua, zat warna tambahan (merah) bertahan hingga zat warna asli tidak tampak disebut Gram negatif.

Proses identifikasi mikroba metode pewarnaan gram dilakukan untuk memisahkan jenis bakteri menjadi 2 kelompok besar, yaitu bakteri gram positif dan bakteri gram negatif.

a.       Bakteri gram positif adalah bakteri yang mempertahankan zat warna kristal violet sewaktu proses pewarnaan gram  sehingga akan berwarna biru atau
ungu jika diamati di bawah mikroskop. Ciri-ciri bakteri gram positif            adalah struktur dinding selnya tebal, sekitar 15-80 nm, berlapis tunggal atau monolayer, dinding selnya mengandung lipid yang lebih normal (1-4%), dan memiliki komposisi peptidoglikan yang lebih besar biasanya 40-60% dari berat kering dinding, dimana komponen utamanya  merupakan asam tekoat yang tersusun 50% dari berat ringannya, bakteri gram positif lebih rentan terhadap penisilin, lebih resisten terhadap alkali (1% KOH) larut, tidak peka terhadap streptomisin dan toksin yang dibentuk adalah eksotoksin.

b.      Bakteri gram negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna kristal violet sewaktu proses pewarnaan gram sehingga akan berwarna merah bila diamati dengan mikroskop. Ciri-ciri bakteri gram negatif yaitu struktur dinding selnya tipis sekitar seperduapuluh dari ketebalan yang ditemukan dalam organisme gram positif yaitu sekitar 10 – 15 nm, berlapis tiga atau multilayer yang terdiri dari lipopolisakarida (LPS), fosfolipid, dan lipoprotein, resistensi terhadap alkali (1% KOH) lebih pekat, peka terhadap streptomisin dan toksin yang dibentuk adalah  endotoksin., dinding selnya mengandung lipid kovalen terikat dengan protein yang disebut lipoprotein, yaitu molekul yang mengikat peptidoglikan ke membran luar. Peptidoglikan ini terletak di periplasma. Selain itu, dinding sel bakteri gram negatif tidak mengadung asam teichoic di dinding sel dan lebih rentan terhadap kerusakan mekanis karena jumlah rendah dari peptidoglikan. Hal ini sesuai dengan Nydia (2016) yang menyatakan bahwa Bakteri gram negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna kristal violet sewaktu proses pewarnaan gram sehingga akan berwarna merah bila diamati dengan mikroskop sedangkan bakteri gram positif akan berwarna ungu dan didukung oleh pernyataan Arrachman (2016) yang menyatakan bahwa dinding sel bakteri gram positif sebagian besar terdiri atas beberapa lapisan peptidoglikan yang membentuk suatu struktur yang tebal dan kaku. Kekakuan pada dinding sel bakteri yang disebabkan karena lapisan peptidoglikan dan ketebalan peptidoglikan ini membuat bakteri gram positif resisten terhadap lisis osmotik dan bakteri gram negatif terdiri atas satu atau sangat sedikit lapisan peptidoglikan pada dinding selnya. Selain itu dinding sel bakteri gram negatif ini tidak mengandung asam teikoik tetapi mengandung sejumlah polosakarida dan lebih rentan terhadap kerusakan mekanik dan kimia.

Dalam melakukan proses pewarnaan gram, tidak lepas dengan adanya proses fiksasi. Fiksasi adalah suatu metode persiapan untuk menyiapkan suatu sampel agar tampak realistik dengan menggunakan grutaldehid dengan proses pemabakaran. Prosedur fiksasi dilakukan dengan melakukan kaca preparat yang telah dijepit dengan penjepit dan dipermukaannya terdapat sampel mikroba, dipanaskan pada api yang dikeluarkan bunsen sampai mikroba pada sampel tersebut melekat sempurna.  Fungsi  fiksasi yaitu melekatkan mikroba pada objek glass, serta untuk memperjelas pengamatan dibawah mikroskop. Proses pemanasan fiksasi dilakukan tanpa merusak struktur dinding sel bakteri. Hal ini sesuai dengan Campbell dan Reece (2005) yang menyatakan bahwa Fiksasi bertujuan untuk mematikan bakteri dan meletakkan sel bakteri pada objek gelas tanpa merusak struktur selnya.

DAFTAR PUSTAKA

Arrachman, Khairunnisa. 2016. Mikrobiologi Pewarnaan. Semarang: Universitas Muhammadiyah Semarang.

Campbell, N.A., J.B. Reece, & L. G. Mitchell. 2010. Biologi. Edisi ke-8. Terj. Dari: Biology. 8^th ed. oleh Manulu, W. Jakarta: Erlangga.

Dwidjoseputro. 2005. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Djambatan. Jakarta.

Hardy, J. 2016. Gram’s Serendipitous Stain. http//hardydiagnistics.com/wpcontect/uploads/201/05/Hans-Christian-Gram.pdf. Diakses pada 27 April 2017 di Makassar.

Fitriani, L. F. 2016. Laporan Mikrobiologi Lingkungan Modul 2 Dan 3 Mikroskop Dan Pewarnaan. Bandung: Fakultas  Teknik  Sipil  Dan  Lingkungan institut  Teknologi Bandung

Nydia, Venny. 2016. Perbedaan Bakteri Gram Positif Dan Gram Negatif. Semarang: Fakultas Ilmu Keperawatan Dan Kesehatan Universitas Muhammadiyah Semarang.

Prastyaharasti, Lila. 2014. Evaluasi Pertumbuhan Lactobacillus casei Dalam Medium Susu Skim Yang Disubstitusi Tepung Beras Merah. Jurnal Pangan dan Agroindustri 2(4) 285-296. Malang: Fakultas Teknologi Hasil Pertanian Universitas Brawijaya

Shiella, M. Y. M. 2012. Efek Pemberian Probiotik Lactobacillus casei terhadap Jumlah Sel Polimorfonuklear Neutrofil Gingiva Tikus Wistar Jantan Yang Diinduksi Lipopolisakarida. Jember: Bagian Biomedik Fakultas Kedokteran Gigi Universitas Jember.

Subandi, 2012. MikroBiologi. Bandung: PT. Remaja Rosdakarya.

Tim Dosen Universitas Syiah Kuala. 2016. Modul I Mikroskop. Aceh: Jurusan Biologi FMIPA Universitas Syiah Kuala.

Wahyuningsih. 2008. Pengecatan Gram. Purwokerto: Fakultas Pertanian Universitas Jendral Soedirman.